Avtor: Marko Cukjati, Vladan Rajić, Darja Paro Panjan, Tanja Premru Sršen, Irena Štucin Gantar, Mojca Grošelj Grenc, Urška Rahne Potokar, Samo Zver

Izvleček

Humani citomegalovirus se prenaša z neposrednim stikom in iatrogeno, s transfuzijo krvnih komponent in presaditvijo tkiv ali organov. Po primarni, večinoma asimptomatski okužbi, ostane v telesu v latentni obliki v CD34 + krvotvornih matičnih celicah kostnega mozga in v monocitih v periferni krvi. Pri bolnikih z oslabljenim imunskim sistemom lahko pride do simptomatske CMV-okužbe ali virusne reaktivacije s pojavom CMV-bolezni s prizadetostjo različnih organov. Preprečevanje prenosa CMV s transfuzijo krvnih komponent je pomembno pri bolnikih s povečanim tveganjem: intrauterine in neonatalne transfuzije, nosečnice, otroci z imunskimi pomanjkljivostmi, bolniki po presaditvi krvotvornih matičnih celic in organov. Najpomembnejši pristopi k preprečevanju prenosa CMV so izbira varnih krvodajalcev, serološko testiranje na prisotnost CMV-protiteles pri krvodajalcih, odstranjevanje levkocitov iz krvnih komponent, inaktiviranje patogenov in racionalna uporaba krvi. Noben od omenjenih ukrepov ne zagotavlja 100-odstotne varnosti, lahko pa se med seboj pomembno dopolnjujejo.

Uvod

Humani citomegalovirus je dvovijačni DNA-virus z lipidno ovojnico iz skupine herpesvirusov (HHV-5) in je specifien za človeka. Prenaša se z neposrednim stikom in iatrogeno, s transfuzijo krvnih komponent in presaditvijo tkiv ali organov. Primarna okužba pogosto poteka brez simptomov, pojav protiteles (serokonverzija) pa je edini pokazatelj prebolele okužbe. Redko se lahko ob primarni okužbi pojavi blaga oblika »mononukleoznega sindroma«. V otroštvu se virus najpogosteje prenaša s slino, v odraslem odbobju pa navadno s spolnim stikom. Po primarni okužbi virus ostane v telesu v latentni obliki v CD34 + hemopoetskih progenitornih (krvotvornih matičnih celicah, KMC) celicah v kostnem mozgu in monocitih v periferni krvi.1,2 Občasno reaktiviranje, ko se virus pojavi v krvi, vzdržuje doživljenjsko imunost in titer specifinih protiteles (Slika 1).

Prevalenca CMV-seropozitivnih v slovenski populaciji je odvisna od socialnih, ekonomskih in higienskih razmer. Če so slabe, je prevalenca okrog 80–90 %, če primerne, pa 40–70 %.3 Med 25.211 slovenskimi krvodajalci, ki so bili testirani na Zavodu RS za transfuzijsko medicino, je bilo pozitivnih 17.175 (68 %). Ocenjeni odstotek serokonverzij v odrasli populaciji je 0,2–1,2 % letno.4,5 Pri bolnikih z oslabljenim imunskim sistemom lahko pride do simptomatske CMV-okužbe ali virusne reaktivacije, kjer lahko virusno breme v krvi dokažemo, CMV-prizadetosti organov ni. Če pa CMV-virus prizadane telesni organ, govorimo o CMV-bolezni. Najpogostejša sta intersticijska pljučnica in hepatitis, lahko pa gre tudi za encefalitis, retinitis, enteritis ali prizadetost kostnega mozga s posledično trombocitopenijo, levkopenijo in anemijo. Do okužbe ploda pri primarni okužbi noseče matere pride v 40 %, pri reaktiviranju virusa v nosečnosti pa pri 0,2–1,8 % plodov. Prirojena citomegalija je ob rojstvu simptomatska le pri 10–15 % novorojenčkov. Znaki prirojene CMV-okužbe ob rojstvu so največkrat: petehije, povečana jetra in vranica, zlatenica, mikrocefalija, nenormalni nevrološki simptomi, trombocitopenija, za stoj rasti ploda, cerebralne kalcifiacije in horioretinitis. Med okuženimi otroki, ki so ob rojstvu brez simptomov, pa ima pozne zaplete okužbe do 15 %. Največkrat se kažejo kot motnje v umskem in gibalnem razvoju ter napredujoča zaznavna naglušnost.6

Prenos CMV s krvnimi komponentami

CMV se lahko prenaša s transfuzijo krvnih komponent, presajanjem krvotvornih matičnih celic (KMC) in organov. Virus se v latentni fazi v periferni krvi nahaja predvsem v monocitih.1,2 CMV DNA je prisotna tudi pri 7–55 % zdravih seronegativnih oseb1,7 okužba s CMV po transfuziji pa se
lahko razvije tako pri CMV-pozitivnih kot tudi negativnih prejemnikih. Pri CMV-pozitivnih prejemnikih lahko pride do okužbe z drugim sevom virusa ali za ponovnim aktiviranjem lastnega virusa. Pri tem igra pomembno vlogo imunomodulatorni učinek krvi.

Vzorci supernatanta odvzete polne krvi CMV-pozitivnih dajalcev so bili sprva vsi negativni, po 3–4 tednih hranjenja pa pozitivni pri 70 % vzorcev, kar je verjetno posledica postopnega sproščanja CMV iz levkocitov med hranjenjem.8 Prehodna viremija je pogosto prisotna v fazi akutne okužbe pred serokonverzijo.9 Kljub prisotnosti virusa v plazmi, prenos s plazemskimi komponentami ni dokazan. 21 CMV-seronegativnih bolnikov po presaditvi KMC, ki so v postopku izmenjalne plazmafereze prejeli povpreč- no 47,6 enot plazme, so spremljali 100 dni po plazmaferezi. Pri nobenem ni prišlo do okužbe s CMV.10

Priporočilo

Preprečevanje prenosa CMV s transfuzijo krvnih komponent je še zlasti pomembno pri bolnikih, pri katerih je dojemljivost za okužbo večja oz. je verjetnost za težji potek okužbe večja. Najpomembnejši pristopi k preprečevanju prenosa CMV so izbira varnih krvodajalcev, serološko testiranje na prisotnost CMV-protiteles, odstranjevanje levkocitov iz krvnih komponent, inaktiviranje patogenov in racionalna uporaba krvi. Nobeden od omenjenih ukrepov ne zagotavlja 100-odstotne varnosti, lahko pa se med seboj dopolnjujejo.

Posebni ukrepi za preprečevanje prenosa CMV so potrebni pri celičnih krvnih komponentah. Mednje uvrščamo eritrocitne, trombocitne in granulocitne pripravke.

CMV – testiranje

CMV lahko ugotavljamo z neposrednim dokazovanjem virusa ali posredno s CMV-specifinimi protitelesi. Neposredno lahko virus dokažemo z določanjem specifinega antigena pp 65, s celičnimi kulturami in z ugotavljanjem virusnih nukleinskih kislin z metodami NAT (angl. Nucelic Acid Testing). Za dokazovanje okužbe pri bolnikih z visokim tveganjem so primernejši testi, ki dokažejo prisotnost virusa in dajejo tudi informacijo o virusnem bremenu. Učinkovitost testiranja z metodami NAT je zaradi majhne količine CMV v periferni krvi v latentni fazi zelo odvisna od uporabljene metode testiranja. Pri seropozitivnih krvodajalcih je bil rezultat testiranja z NAT pozitiven le v 71 %.1 Po drugi strani pa je bilo testiranje pozitivno pri 14 % vzorcev periferne krvi seronegativnih krvodajalcev oziroma v 55 % pri testiranju z monociti obogatenih vzorcev.1 Zaradi večjega števila lažno pozitivnih in negativnih rezultatov testiranja z NAT in težav pri tolmačenju kliničnega pomena pozitivnega rezultata, NAT CMV ne uporabljamo v sklopu obveznega presejalnega testiranja krvodajalcev.1,11-14 Testiranje NAT CMV je tudi metoda izbire pri aktivnem iskanju CMV-reaktivacije ali bolezni pri imunokompromitiranih hematoloških bolnikih. Zaradi praviloma izrazite imunske zavore izvidov seroloških CMV-testiranj praviloma ne moremo uporabiti klinično. Določanje antigena pp65 je zaradi slabše občutljivosti in kasnejšega pojava pri nižjih virusnih bremenih manj primerna metoda ugotavljanja CMV-statusa krvodajalcev z latentno okužbo.

CMV – testiranje

Kot presejalno testiranje za krvodajalce je primernejše serološko testiranje, ki ostane pozitivno po preboleli okužbi praviloma vse življenje (Slika 1). S hkratnim določanjem protiteles IgM in IgG se učinkovitost testa za ugotavljanje subklinične akutne faze okužbe poveča. Večina danes dostopnih komercialnih testov za določanje CMV IgG/IgM protiteles ima specifinost, ki je večja od 97 % in občutljivost vsaj 94 %. Krvodajalci s svežo okužbo in slabim protitelesnim odzivom (tj. z nizkimi titri protiteles) predstavljajo tveganje za prenos CMV kljub serološkem testiranju.

Slika 1: Titer specifičnih protiteles IgM in IgG ter avidnost protiteles IgG glede na čas od primarne okužbe oziroma reaktivacijo virusa.

Priporočilo

Kot presejalni test za krvodajalce je primerno določanje protiteles IgM in IgG. Kljub negativnemu rezultatu obstaja verjetnost prenosa CMV s transfuzijo od dajalca, ki je v akutni fazi bolezni oziroma ima nizek titer protiteles.

V primeru suma na prenos CMV s transfuzijo je primerno testiranje z metodami NAT, določanje protiteles IgM in testiranje avidnosti. Testiranje z metodami NAT je metoda izbire tudi pri diagnosticiranju CMV-reaktiviranja ali okužbe pri imunsko pomanjkljivih osebah.

Uporaba seronegativnih krvnih komponent

Uporaba krvnih komponent CMV-seronegativnih dajalcev je že dolgo uveljavljeni pristop za zmanjševanje tveganja za prenos CMV s transfuzijo krvnih komponent.15-17 Zaradi nizkih titrov protiteles ali odsotnosti protiteles v akutni fazi bolezni je test lahko lažno negativen. Pri bolnikih po presaditvi KMC CMV-negativnega darovalca, ki so prejemali CMV seronegativne komponente oziroma komponente netestiranih krvodajalcev, je bila incidenca CMV-okužb 6 % oz. 37 %.18 Podobno so bolniki po presaditvi KMC, ki so prejemali CMV seronegativne komponente, v kombinaciji z intravenskim imunoglobulinom (IVIG) razvili znake okužbe v 5 % v primerjavi s 40 % pri bolnikih, ki so prejemali netestirane komponente.19 Uporaba CMV seronegativnih komponent zmanjša incidenco CMV-okužb pri bolnikih z velikim tveganjem na približno 1–3 %.16,17

Serološko testiranje praviloma izvedemo ob naročilu krvne komponente. Skupni čas, potreben za zagotovitev ustrezne krvne komponente od naročila do izdaje, je od 2 ur in 45 min do 4 ur (Slika 2). Ob nujni transfuziji je testiranje smiselno samo takrat, ko je tveganje zaradi odložitve transfuzije manjše od tveganja v povezavi s prenosom CMV. Ob tem moramo upoštevati tudi druge razpoložljive ukrepe, ki so opisani v naslednjih točkah.

Slika 2: diagram poteka postopkov pri zagotavljanju eritrocitnih krvnih komponent CMV-seronegativnih krvodajalcev. Skupni čas testiranja je približno 1ura in 45 min. Zunaj rednega delovnega časa se lahko ta čas podaljša do 1 ure, kolikor je potrebno za vpoklic laboratorijskega osebja iz službe stalne pripravljenosti. Skupni čas od naročila do izdaje (vključno s predtransfuzijskim testiranjem) je lahko do 4 ure.

Priporočilo

Uporaba CMV seronegativnih krvnih komponent zmanjša tveganje za prenos CMV s transfuzijo in je eden od načinov preprečevanja okužbe pri CMV-negativnih bolnikih z večjim tveganjem. Mednje uvrščamo:

• bolnike, pri katerih načrtujemo alogenično presaditev KMC, če so CMV-negativni;
• bolnike ob alogenični presaditvi KMC, če je prejemnik CMV-negativen;
• bolnike po avtologni presaditvi KMC, če so bolniki CMV negativni;
• nosečnice.

Uporaba CMV seronegativnih krvnih komponent je potrebna pri:

• vseh intrauterinih transfuzijah;
• izmenjalnih in drugih transfuzijah novorojenčkov s porodno težo pod 1500 g;
• otrocih z imunskimi pomanjkljivostmi.

Uporaba krvnih komponent z odstranjenimi levkociti

V skladu s strokovnimi priporočili in z zakonodajo mora krvna komponenta z odstranjenimi levkociti vsebovati manj kot 1 x 106 levkocitov.20,21 Ta pogoj mora izpolnjevati vsaj 90 % testiranih enot. Mejna vrednost je bila določena eksperimentalno glede na verjetnost HLA-aloimunizacije po transfuziji. Stopnja levkoredukcije, potrebna za preprečevanje prenosa CMV, ni opredeljena. Čeprav levkoredukcija za 3–4 log zmanjša virusno breme v trombocitnih in eritrocitnih komponentah, s tem ne zagotovimo popolne odsotnosti virusa.22 Pri seropozitivnih osebah je približno 0,2 % levkocitov v periferni krvi latentno okuženih.16 Po odstranjevanju levkocitov s fitriranjem ostane v krvi manj kot 0,1–0,01 virusnih kopij na ml pripravka23 oziroma manj kot 1000 latentno okuženih levkocitov.

Poleg zmanjševanja virusnega bremena je odstranjevanje levkocitov povezano tudi z zmanjševanjem imunomodulatornega učinka transfuzije krvnih komponent.24 Pomembna je zlasti imunosupresivna komponenta imunomodulacije, ki je lahko povezana z večjo verjetnostjo reaktiviranja endogenega CMV v prejemniku. Raziskave na živalskih modelih so potrdile pomembno vlogo alogenične stimulacije pri reaktiviranju latentnega CMV-virusa.25 Prav tako so ugotovili reaktiviranje CMV v mieloidni celični liniji po alogenični stimulaciji krvotvornih matičnih celic v periferni krvi in vitro.26

S pranjem v fiziološki raztopini iz eritrocitnih komponent odstranimo približno 90 % levkocitov, kar pomeni 107–108 preostalih levkocitov na enoto. Več raziskav pri novorojencih je pokazalo, da je pranje slabo učinkovito pri preprečevanju prenosa CMV (stopnja prenosa CMV po pranju 1,5–15 %). S kombinacijo postopkov zamrzovanja in odmrzovanja eritrocitov s pranjem zmanjšamo število levkocitov za 94–98 %. Stopnja prenosa CMV pri bolnikih na dializi in bolnikih po presaditvi krvotvornih matičnih celic, ki so prejemali predhodno zamrznjene eritrocitne komponente, je bila 0,8 %, kar je primerljivo kot pri uporabi seronegativnih komponent.16

Med različnimi tehnikami odstranjevanja levkocitov je najpomembnejše fitriranje. Že uporaba prvih generacij fitrov s stopnjo levkoredukcije 2–3 log je učinkovito zmanjšala verjetnost prenosa CMV.27,28 Odstranjevanje levkocitov učinkovito zmanjša pogostost prenosa CMV s transfuzijo pri neonatalnih bolnikih, bolnikih z akutno levkemijo in po presaditvi KMC.16,17 Filtri tretje generacije odstranijo z mehanizmom neposredne vezave in posredno preko aktiviranih trombocitov celo več kot 4 log levkocitov. Sodobni fitri so še posebej učinkoviti pri odstranjevanju monocitov, ki so glavni nosilci latentnega CMV-virusa. Sodobne naprave za aferezo omogočajo s kombinacijo centrifugiranja in elutricije selektivno zbiranje trombocitov, ne da bi jih bilo potrebno dodatno fitrirati. Najučinkovitejše je fitriranje v prvih 24 urah po odvzemu; levkociti se namreč odstranijo, še preden sprostijo v okolni medij citokine, fragmente celične membrane in znotrajcelične viruse. Na ZTM smo leta 2009 prešli na odstranjevanje levkocitov iz vseh eritrocitnih in trombocitnih krvnih komponent. Krvne komponente, ki jih pripravimo iz odvzete polne krvi, fitriramo z visokozmogljivimi fitri tretje generacije. V postopkih zbiranj posameznih krvnih komponent z aferezami je že samo po sebi dovolj selektivno, zato fitracija teh komponent ni vedno potrebna. V letu 2011 smo v sklopu rednih mesečnih kontrol kakovosti eritrocitnih in trombocitnih komponent testirali 685 vzorcev, od tega je bilo pri 670 vzorcev (97,8 %) število levkocitov manjše od 1 x 10 e6 (Tabela 1).

Odstranjevanje levkocitov ima tudi druge ugodne učinke na varnost krvnih komponent, kot so zmanjšanje aloimunizacij in nehemolitičnih vročinskih reakcij ob transfuziji. Uvedba obveznega odstranjevanja levkocitov iz vseh krvnih komponent je v primerjavi z zagotavljanjem CMV-seronegativnih komponent učinkovitejši pristop z vidika razpoložljivosti komponent, časa za pripravo in manjše verjetnosti napak. Po Priporočilih Sveta Evrope so celične komponente z odstranjenimi levkociti varen nadomestek CMV-seronegativnih komponent, če te niso na voljo. Tudi nekatere nacionalne smernice menijo, da so komponente z odstranjenimi levkociti učinkovita alternativa CMV-negativnim komponentam.29

Priporočilo

Krvne komponente z odstranjenimi levkociti so učinkovita alternativa CMV-seronegativnim komponentam za preprečevanje prenosa CMV pri bolnikih z večjim tveganjem. Odločitev o bolj ustrezni komponenti je odvisna tudi od razpoložljivosti komponente oz. nujnosti transfuzije. Z odstranjevanjem levkocitov se zadovoljivo zmanjša tveganje za prenos CMV, razen pri posameznih bolnikih, ki jih posebej obravnavamo v naslednjih točkah. Priporočilo velja tudi za bolnike po presaditvi krvotvornih matičnih celic, presaditvi organov in za bolnike z imunsko pomanjkljivostjo.

Po primarni okužbi je virus v krvi prisoten v celičnih in plazemskih sestavinah do pojava serokonverzije 6–8 tednov po okužbi.30,31 CMV DNA je bila prisotna v plazmi pri 44 % krvodajalcih, ki so postali seropozitivni od zadnjega darovanja krvi, tj. pri 0,13 % vseh testiranih enot.31 CMV DNA so ugotavljali do 269 dni po primarni okužbi. Ko virusa v krvi ne moremo več dokazati, izginejo tudi protitelesa IgM, pojavijo pa se protitelesa IgG.32 V obdobju do serokonverzije se lahko kljub odstranjevanju levkocitov CMV prenese s krvnimi komponentami, bodisi kot prosti virus v plazmi ali v preostalih levkocitih.

Priporočilo

Pomemben ukrep, s katerim učinkovito zmanjšamo tveganje za prenos CMV od krvodajalca s primarno okužbo v obdobju pred serokonverzijo, je zavrnitev krvodajalcev z znaki akutne virusne okužbe v anamnezi. Ker primarna okužba pri zdravih osebah pogosto poteka brez simptomov, je to le delna rešitev težave.

Inaktiviranje patogenov v krvnih komponentah

V klinični uporabi so različne tehnike za inaktivacijo patogenov v trombocitnih in plazemskih komponentah. Temeljijo na nepovratnem uničevanju DNA s kombinacijo fotosenzibilizatorja in UV-žarkov ali samo UV-žarkov. Učinkovito se inaktivira tudi CMV s stopnjo redukcije, večjo do 5,9 log, kar omogoča opustitev CMV-testiranja.33

V razvoju so sistemi za inaktiviranje polne krvi oz. eritrocitov. Uvedba univerzalnega inaktiviranja vseh krvnih komponent bi omogočila opustitev nekaterih drugih ukrepov za zmanjševanje tveganja za prenos nalezljivih bolezni s transfuzijo, hkrati pa povečala varnost krvnih komponent tudi z vidika novih in porajajočih se nalezljivih bolezni. Inaktiviranje patogenov v krvnih komponentah ima tudi druge ugodne učinke, kot sta daljši rok uporabnosti trombocitnih komponent in opustitev obsevanja gama za preprečevanje reakcije presadka proti gostitelju (GVHD) po transfuziji.

V Sloveniji smo pričeli s tehniko psoralenskega fotoinaktiviranja patogenov v trombocitnih komponentah leta 2009. V letu 2011 smo na ta način obdelali 93 % trombocitov pridobljenih iz polne krvi in 90 % afereznih trombocitnih komponent. Preostale komponente smo izdali zaradi nujnih naročil v neinaktivirani obliki.

Priporočilo

Krvne komponente, ki so obdelane s tehniko virusne inaktivacije, so tudi z vidika prenosa CMV bolj varne kot fitrirane ali seronegativne komponente. Uvajanje tehnologije inaktiviranja na vse krvne komponente lahko izboljša razpoložljivost in varnost krvnih komponent.

Bolniki po presaditvi KMC

V veliki randomizirani prospektivni klinični raziskavi, v kateri so primerjali učinkovitost serološkega testiranja in fitriranja pri preprečevanju prenosa CMV, ni bilo statistično značilne razlike v pojavnosti CMV okužbe med 21. in 100. dnem po presaditvi KMC in tudi ne v preživetju obeh skupin bolnikov.34 Prav tako ni značilnih razlik v pogostosti okužb s CMV med bolniki, ki so prejemali seronegativne in fitrirane komponente, ter bolniki, ki so prejemali samo fitrirane kompontne.35

Metaanaliza 9 raziskav, v katere je bilo vključenih skupaj 879 bolnikov po alogenični ali avtologni presaditvi KMC in bolnikov z levkemijo, je prišlo do CMV-okužbe pri zgolj treh bolnikih (0,5 %) od skupaj 554 bolnikov, ki so prejemali CMV-seronegativne in fitrirane pripravke, v primerjavi z dvema bolnikoma (0,8 %) od skupaj 252, ki so prejemali le CMV-seronegativne nefitrirane komponente.36 Vsi trije bolniki s CMV okužbo so prejeli transfuzijo krvnih komponent, ki so bile fitrirane ob bolnikovi postelji, kjer nadzor nad kakovostjo fitrirane komponente ni bil mogoč.34

Tako uporaba krvnih komponent z odstranjenimi levkociti kot krvnih komponent CMV-seronegativnih dajalcev učinkovito zmanjša tveganje za prenos CMV na 1,5 do 3 % pri bolnikih po presaditvi KMC.37

Spremljanje CMV-statusa bolnika s testiranjem NAT in zgodnje predbolezensko zdravljenje učinkovito zmanjšata umrljivost zaradi CMV-okužbe oziroma bolezni pri prejemnikih KMC.

Priporočilo

Pri vseh bolnikih po presaditvi KMC so krvne komponente z odstranjenimi levkociti ustrezno nadomestilo za CMV-negativne komponente ne glede na CMV-status dajalca oz. prejemnika. Tudi pri bolnikih, ki so predvideni za zdravljenje s presaditvijo KMC, je uporaba krvnih komponent z odstranjenimi levkociti zadosten ukrep. Redno spremljanje CMV-statusa bolnika med presaditvijo KMC in po njej z odkrivanjem DNK CMV s PCR omogoča zgodnje diagnosticiranje reaktivacije CMV oz. primarne okužbe s CMV in posledično učinkovito predbolezensko zdravljenje okužbe.

Tabela 1: Število levkocitov v eritrocitnih in trombocitnih krvnih komponentah, pripravljenih na ZtM v letu 2011 (rezultati rednih mesečnih kontrol kakovosti).